실험 1 : Sephadex gel에 의한 헤모글로빈의 분리
-실험 목적 :
단백질 혼합물을 Size exclusion chromatography통해 분리할 수 있다.
곧, 미지의 단백질을 알 수 있다
크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는
젤 여과 크로마토그래피(gelfiltration chromatography)는
크기에 따라 단백질을 분리하는 방법이다.
실험 원리
Sepahdex Gel을 자세히 보면 pore과 빈공간으로 되어 있다. 작은것들은 pore을 통과하여 분산될 수 있지만 큰것들을 그러지 못하여 사이사이로 내려가 결국 분자량이 작은 것은 천천히 내려오고 무거운 것이 빨리 내려오게 된다.
실험 과정
준비물 :
크로마토그래피 glass column, sephadex G-100, 마이크로 피펫 세트,
분쇄된 전혈, BP(blue detran), BPB의 혼합물
만들어진 GEL을 이용하여 직접 시료 loading을 했다. 시료를 놓기 위해 밸브를 열어 완충액 수면이 젤 표면에 거의 닿을 때 다시 잠근다. 이 실험에서는 인산완충액을 사용하였는데 완충액의 역할은 시료가 흘러 내려갈 수 있도록 도와주는 역할이다. 그렇기에 시료를 놓은 뒤 완충액이 마르지 않도록 지속적으로 넣어 주어야 한다. 시료는 gel 전체부피의 1퍼센트은 180ul를 넣어줬다. 시료를 젤 표면이 일어나지 않도록 벽면을 따라 마이크로피펫을 이용해 서서히 가한다. 96plate에 well, 구멍 하나당 용출액을 3방울씩 담아준다. 3방울씩 받아 시료의 분리가 끝나면 well 당 용출액의 부피를 측정하고 각 시료들의 peak점을 색상으로 확인한다. 우리는 한 well당 150ul이었다.
다음은 헤모글로빈의 Kav를 구하여 대략적인 분자량을 측정하는 과정이다. Kav 값은 아래 그림과 같이 구하는데 각 항목을 설명하자면 Vt는 토탈 볼륨으로 gel이 차있는 1cm 당 1000ul로 계산했고 우리는 18.5cm 였다. Ve는 peak까지의 부피로 well당 부피*그까지 well수(57개) 로 구했다. Vo는 gel에서 pore을 제외한 부분으로 가장 분자량이 커서 가장 먼저 아래에 도달하는 혼합물 속 BD의 피크까지 well 수 (48번째)로 계산하였다.
Kav 값이 클수록 분자량은 작게 된다.<-이것은 기존 단백질과 sephadex gel종류에 따라 만든 함수식에 넣어 알 수 있다. Y=-0.5511Log(MW)+2.8114
실험 결과
Vt=18500ul
Vo=7200ul
Ve=150x57㎕=8550㎕
Kav 값
-Blue dextran : 0
Hb : 0.119469
MW 값
-Blue dextran : 125,602
-Hb : 76,032
실험에대한 고찰
실제 blue dextran의 분자량은 200만 이고 Hb MV는 64000이다.
오류가 생긴 이유를 분석해보면 다음과 같다
-시료를 넣는 과정에서 팁으로 gel을 찌르면서 용출 부피에 큰 오차가 생겼다
-1well의 부피를 정확히 재지 못했다-->모든 well부피가 같다고 전제했다.
-peak점 선택을 제대로 하지 못했다
-Vo 값에 오차가 있다-->자로 대략적으로 쟀다
실험2 : 흡광도를 이용해서 단백질 정량
peak well을 앞뒤로 3개의 well을 모아 labelling한다. 562nm에서 흡광도를 측정한다.
단백질 표준용액으로 작성한 graph를 통해 분리된 Hb의 농도를 결정한다.
실험3 : SDS PAGE에 의한 단백질 분석-정량적 분석
전기영동 : 단백질과 같이 하전된 입자가 양,음극쪽으로 이동하는 것을 분석한다.