La Espectroscopia Raman se adapta perfectamente a la microscopia confocal, ya que permite un aumentar el contraste, definición de imágenes y a su vez construir y obtener información tridimensional.
Marvin MinskyCC BY-SA 2.0 de Flickr Steamtalks
Por medio de este microscopio podemos observar espectros de muestras químicas y biológicas. La invención del microscopio confocal en principio fue para el estudio de eventos biológicos y neurológicos que se producen en vivo, esto fue gracias al científico Marvin Minsky cuyo objetivo principal en su estudio era obtener información de redes neuronales usando preparaciones no coloreadas del tejido cerebral vivo. La ventaja de crear este tipo de técnica es en principio tener un enfoque exacto con una imagen confocal usando un orificio de abertura o agujero del tamaño de un alfiler, permitiendo una definición muy nítida de la imagen de las muestras más gruesas del plano focal del microscopio.
Con el transcurrir de los años y diferentes avances tecnológicos este microscopio fue tomando mucha popularidad, siendo así usado por diferentes científicos de diferentes áreas para estudiar muestras vivas y obtener información tridimensional de las mismas. Hoy en día la usamos para análisis químicos de muestras de materiales y se acopla perfectamente a la espectroscopia debido a su sencilla configuración.
Imagen TRIDIMENSIONAL de la célula Mesodermes Pre-somiticas y somitas formación en embriones de pollo (Gallus gallus) 2 Aumento 40XCreative Commons - Atribución 3.0 - Facultad de Ciencias de la Universidad de Lisboa.
Como acabo de mencionar le espectroscopia Raman se acopla muy bien a el microscopio confocal permitiendo obtener un espectro característico de alguna muestra en especifica en cada pixel de la imagen, este tipo de sistema imagenológico tiene la capacidad de tener una resolución en escala nanométrica de cualquier material.
Podemos obtener información espectral usando diferentes técnicas espectroscópicas como, por ejemplo: absorción, transmisión, reflexión, fotoluminiscencia, emisión, fluorescencia y por supuesto Raman. Sin duda alguna la técnica Raman es la preferida por muchos científicos porque es basada en la dispersión inelástica de la luz monocromática cuando en los fotones su frecuencia cambia al momento de la interacción con el material.
Los fotones de la luz láser son absorbidos por la muestra y reemitidos posteriormente. La frecuencia de los fotones emitidos se desplaza hacia arriba o hacia abajo en comparación con la frecuencia monocromática original, que se conoce como efecto Raman. El cambio Raman proporciona información sobre las energías vibratorias y rotacionales de los enlaces moleculares.
Microscopio confocal ZEISS LSM 800flickr.com
En la actualidad existen diferentes microscopios confocales avanzados que se pueden acoplar a la espectroscopia permitiendo a los usuarios estudiar muestras con superficies rugosas e irregulares, ya que durante el barrido de la muestra se puede obtener un enfoque óptimo en tiempo real a través de un video con luz blanca. Todo esto permitiendo mayor facilidad de maneja a los usuarios, ya que no se necesita un enfoque manual.
Con el transcurrir de los años se pudo observar que la técnica de espectroscopia confocal Raman era la indicada para determinar los niveles de energía y modos vibracionales dentro de una molécula, dicho esto tiene la gran ventaja que con solo excitar una pequeña parte de la molécula cambiando la longitud de onda de excitación, podíamos tener este tipo de información muy exacta. El simple hecho de adaptar a un microscopio un espectrómetro Raman nos proporciona un volumen de muestreo muy controlado, con esto quiero decir que solo necesitamos un filtro espacial para realizar el análisis de la muestra.
Niveles de energía del efecto RamanCreative Commons Attribution-Share Alike 2.5 de Pavlina2.0
Hoy en día se usan diferentes métodos para unos más prácticos, otros no. Sin embargo, la espectroscopia Raman adaptada al microscopio confocal nos brinda la posibilidad de analizar partículas individuales con dimensiones inferiores a 1µm y esto es fabuloso porque ningún otro método tiene esta capacidad. Además de mencionar todo esto no podemos olvidar que para esta técnica no se necesita ningún tipo de preparación para las muestras que se desean analizar, esto permite al usuario un ahorro de tiempo y por supuesto el reutilizar la muestra para análisis posteriores porque las muestra a su vez no se destruyen.
Otro punto importante que deseo acostar acerca de La espectroscopia confocal Raman es que nos muestra espectros con bandas afiladas y muy características en los enlaces moleculares específicos de cada muestra del material analizado, es decir, viene siendo como su huella dactilar.
Espectro Raman en escala longitud de ondalicencia Creative Commons Attribution-ShareAlike de Quang-Viet Nguyen
La intensidad de las bandas en un espectro Raman es proporcional a la concentración de las moléculas correspondientes y, por lo tanto, se puede utilizar para el análisis cuantitativo.
Aunque en el análisis de ciertos tipos de muestras como, por ejemplo, células y tejidos las características espectrales nos dan información sobre ciertos componentes celulares, entonces nos permite especificar muy detalladamente para el análisis cualitativo y así discriminar entre materiales muy parecidos.
Celulas Estaminales Creative Commons - Atribucion 3.0
Algunos estudios que se han hecho con esta técnica son en muestras biológicas como mencione en la primera parte del post, específicamente en la identificación de células, permitiendo que las bandas resalten y así poder identificar regiones de la membranas de la célula.
Estudios aplicados en las ciencias de los materiales como por ejemplo el grafeno. De igual forma aplicaciones en la industria farmacéutica en la fabricación de diferentes tipos de medicamentos.
Para culminar y en resumen esta técnica ofrece muchas ventajas ya que la preparación de la muestra es sumamente sencilla, no se requiere de una preparación específica, contiene un ensayo no destructivo, podemos identificar fases directamente, a su vez se puede realizar análisis a sólidos cristalinos y amorfos y por supuesto materiales biológicos, permitiendo identificar las propiedades de cada material en una imagen tridimensional con una resolución alta, además el rango de variación de la temperatura esta entre 250 y 600 ºC.
Para más información
¿Qué es la microscopia Raman confocal?
Fuentes de la imagen de portada Creative Commons Attribution-Share Alike 4.0CC BY-SA 3.0 Creative Commons Attribution 3.0
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Saludos estimado carlos entiendo muy poco pero si estoy familiarizada con los espectros ya que tengo muchos amigos en el área farmacéutica. Cuando menciono que entiendo poco es porque la teoría envuelta detrás de este tipo de experimentos y resultados experimentales es bastante compleja, por eso siempre he dicho que la física es la ciencia más compleja, pero muy fascinante! :)
Muchas doctora, trato de hacerlo lo más digerible posible ya que el tema es bastante pesado, a veces algunos temas sobre la física es casi imposible interpretarlos en un lenguaje coloquial o más accesible para la mayoría de los lectores, de igual aprecio que te tomaras el tiempo de leerlo y quizás entendieras un 10% del mismo jejeje
De nada siempre es un gusto poder leer tus escritos tan perfectos!
Excelente contenido!
gracias muy amable!
gracias muy amable!
Hola @carloserp-2000 a pesar de que no es mi área, esta muy didáctico la forma como lo explicaste, y me gusto bastante a pesar de no haber entendido algunos términos.
Eso está información es esquisita